Исследование эффективности препарата ЭпиВакКорона: дискуссия

«Однако иммунизация пептидами может вызывать выработку антител, аффинных к полноразмерному белку, лишь в исключительных случаях (Goding, 1996), и зачастую антипептидные антитела используют в молекулярной биологии для работы с денатурированным белком, утратившим пространственную структуру».

Вектор:

Данное рассуждение представляется не соответствующим действительности и является источником дальнейших оценок, которые нельзя назвать верными. Выдвигаемый тезис не учитывает контекст описания моноклональных антител в цитируемой работе. Моноклональные антитела обладают уникальной специфичностью, они гораздо более чувствительны к аминокислотным заменам, нежели поликлональные антисыворотки. Так, замена остатка в антигенной детерминанте уменьшает связывание моноклональных антител в среднем в 5-50 раз. Наука не стоит на месте и то, что считалось раньше невозможным или крайне сложным, в настоящее время вошло в практику. Есть достаточно большое количество примеров, когда линейные эпитопы позволяют наработать ингибирующие и вируснейтрализующие антитела. Правильно выбранные пептиды часто (почти всегда) вызывают наработку антител, перекрёстно реагирующих с целевым агентом.

Комментарий исследовательской группы

Как правило, перед тем, как заявить некое утверждение со ссылкой на источник не соответствующим действительности, в научных кругах принято сначала знакомиться с этим источником.

Название книги «Monoclonal Antibodies» не означает, что речь в ней идет исключительно о моноклональных антителах. Конкретно в цитируемом разделе (4.7, с. 59-60) никаких упоминаний моноклональных антител нет вовсе. Более того, речь идет конкретно о сыворотках ("reactivity of antipeptide sera with the native protein"). Впрочем, из официального ответа неясно, каким образом моноклональные антитела в этом контексте отличаются от поликлональных - снижение аффинности моноклональных антител при аминокислотной замене в эпитопе приведено без сравнения с поликлональными антителами.

Приведенные в п.1 официального ответа тезисы наподобие "Есть достаточно большое количество примеров, когда линейные эпитопы позволяют наработать ингибирующие и вируснейтрализующие антитела" не подкреплены никакими литературными данными и являются оценочным суждением. То, что "в настоящее время вошло в практику", так и не было ни разу зарегистрировано в виде вакцинных разработок. Ссылок на источники, в которых описано "вхождение в практику", авторы официального ответа не предоставили. Приведенные пептидные вакцины, дошедшие до различных фаз клинических испытаний, направлены на формирование клеточного ответа и по сути представляют из себя принципиально иной тип вакцин.

Мы считаем неуместным сравнение с клеточно-ориентированными пептидными вакцинами

«В настоящий момент не существует ни одной зарегистрированной пептидной вакцины, которая способна индуцировать гуморальный ответ. В разное время исследователи пытались создать прототипы таких вакцин: например, существовали разработки ветеринарных пептидных вакцин от ящура (DiMarchi et al., 1986; Wang et al., 2002). Оболочечный белок вируса ящура (FMDV) VP1 использует для связывания с рецептором доступную с поверхности петлю без вторичной структуры, которую можно сымитировать с помощью пептида из 20-40 аминокислотных остатков (Bittle et al., 1982) Однако из-за низкой эффективности эти разработки не получили дальнейшего развития и не применяются в ветеринарии (Taboga et al., 1997)».

Вектор:

В данном вопросе авторы ссылаются на старые источники. Есть множество примеров картирования линейных эпитопов, антитела к которым обладают нейтрализующим действием. Есть такие примеры и для SARS-CoV-2. Действительно, в настоящее время единственными пептидными вакцинами, одобренными для человека, являются «ЭпиВакКорона» и «ЭпиВакЭбола». Вместе с тем, проводится большое количество клинических исследований пептидных вакцин, некоторые из которых дошли до III стадии. Это касается, в частности, вакцин от гриппа. В основном, пептидные вакцины нацелены на индукцию Т-клеточного иммунного ответа, а не гуморального, однако это обусловлено не принципиальной невозможностью создания таких вакцин, а тем, что в иммунотерапии онкологических заболеваний именно Т-клеточный иммунный ответ играет ведущую роль.
Работы по пептидной вакцине против FMDV были приостановлены по причине достижения научного результата. При наличии инактивированных вакцин продолжение разработки дорогостоящей (в то время) пептидной вакцины в ветеринарии было нецелесообразным. Кроме того, вирус ящура – высоковариабельный вирус, и мутации по данному району могут привести к снижению эффективности вакцины.

Комментарий исследовательской группы

Авторы обсуждаемой статьи охотно сослались бы на более новые источники, но во всех новых источниках описываемые т.н. peptide-based vaccines ориентированы на клеточный ответ, как совершенно правильно заметили сотрудники "Вектора" в п.2 официального ответа. Интерес к пептидным вакцинам от ящура значительно снизился не в связи с достижением научного результата, а в связи с их крайне низкой эффективностью (Taboga O. et al. A large-scale evaluation of peptide vaccines against foot-and-mouth disease: lack of solid protection in cattle and isolation of escape mutants //Journal of virology. – 1997. – Т. 71. – №. 4. – С. 2606).

В свете того, что в ответе содержится согласие с основными процитированными из статьи тезисами, назначение п.2 ответа неясно.

«Вместо этого сероконверсия оценивается с помощью тест-системы «SARS-CoV-2-IgG-Вектор», которую производит разработчик вакцины и которая недоступна ни для коммерческих, ни для исследовательских лабораторий, не аффилированных с разработчиком. Состав антигена этой тест-системы неизвестен, а воспользоваться ей можно только по предъявлению документа о вакцинации «ЭпиВакКороной» и только в нескольких аффилированных с Роспотребнадзором лабораториях».

Вектор:

Это утверждение не соответствует действительности. Сероконверсия проверялась в отношении нативных и рекомбинантных вирусных антигенов, инактивированного вируса. Исследовалась и вируснейтрализующая активность иммунных сывороток – соответствующие методики и результаты описаны, в том числе, в опубликованных статьях.
Для выявления сероконверсии против коротких пептидов с более высокой чувствительностью необходима специально разработанная оригинальная тест-система «SARS-CoV-2-IgG-Вектор», которая регистрирует как антитела, индуцированные вакциной «ЭпиВакКорона», так и антитела у переболевших людей. Тест-система «SARS-CoV-2-IgG-Вектор» доступна, в том числе, для коммерческих лабораторий, включая «Лабораторную службу Хеликс». Состав тест-системы подробно описан (https://roszdravnadzor.gov...., 2020/12952).

Комментарий исследовательской группы

Утверждение, процитированное в п.3 официального ответа, является объективной действительностью. Содержащиеся в п.3 претензии непонятны: кем, где и зачем проверялась сероконверсия, о каких статьях вообще речь - ведь в процитированном тезисе речь о том, какой тест-системой разработчик рекомендует проверять сероконверсию после вакцинации не в рамках каких-либо исследований. Выявление антител у переболевших с помощью тест-системы SARS-CoV-2-IgG-Вектор связано, по-видимому, с наличием N-белка в составе антигена, поскольку антитела вакцинированных Спутником V с помощью этой тест-системы удалось выявить лишь в двух случаях из ~10 (данные не показаны), причем полученные результаты были близки к референсным значениям, что наводит на мысль о низкой специфичности тест-системы. Приведенная ссылка с “подробно описанным составом” не содержит ни единого внятного указания на состав антигена, который является единственным по-настоящему интересным моментом.

На момент написания материала в Хеликсе еще не было возможности сдать этот анализ, однако мы уверены, что купить данную тест-систему невозможно, и Хеликс с CMD просто берут кровь и затем отвозят в институты Роспотребнадзора, в которых проводят анализ.

Если авторы официального ответа утверждают, что тест-систему можно купить, мы были бы очень признательны, если бы они связались с нами по электронному адресу, указанному в статье, мы охотно приобретем этот набор реагентов для своих дальнейших исследований.

Комментарий Ольги Матвеевой

Я недавно объяснила каким образом в оценки уровня и качества антител при разработке ЭпиВакКороны закрались артефакты. Если совсем кратко, то:

1. Все тест системы, используемые Вектором для измерения уровня антител у людей, а именно SARS-CoV-2-ИФА-Вектор, Вектор ИФА Корона-АТ, SARS-CoV-2-IgG-Вектор включают в качестве антигена, в том числе, вирусный нуклеокапсидный белок. До сих пор никто из ученых в мире не доказал, что антитела на этот белок могут принимать участие в защитном противовирусном гуморальном ответе. Пока что согласно мировому научному консенсусу только антитела на нативный шиповидный вирусный белок (S-белок) могут быть протективными. Поэтому выявляемые антитела на нуклеокапсидный белок нельзя считать защитными. Так или иначе тест системы измеряют уровень антител, который с защитой от вируса может быть никак не связан. Измерение уровня нуклеокапсидного белка это косвенный артефакт системы. Измеряем одно, а надеемся, что видим другое.
2. В процессе скринирования пептидов в экспериментах с кроликами для оценки гуморального ответа на каждый пептид в ИФА тестах использовался ренатурированный шиповидный белок. Денатурация белка, происходила при сравнительно высоких уровнях pH в процессе иммуноабсорбции. При ренатурации могли не восстановится участки третичной и четвертичной структры белка. Поэтому самые иммуногенные пептиды для кроликов могли провоцировать выработку антител на участки шиповидного белка которые скрыты во третичной или четвертичной структуре шиповидного белка в натиной форме в вирусной частице.
3. Для изготовления цельновирионных тест систем разработчики использовали сравнительно бетапропиолактон для инактивакции вируса. Инактивации вируса бетапропиолактоном даже и при более мягких условиях, чем у разработчиков может приводить у слущиванию S1 субъединицы с S-белка статья в Science https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33058760/. В результате меняется структура. Некоторые эпитопы невидимые в нативном шиповидном белке становятся видимыми для анатител. Экспериментаторам кажется, что в ИФА тестах они видят антитела, которые способны связаться с вирусом, а на самом деле эти антитела могут связаться только с областями частично денатурированных белков и только в ИФА тесте.

«Согласно опубликованным результатам I-II фаз клинических испытаний, сероконверсия к антигенам вакцины «ЭпиВакКорона» составила 100% (Ryzhikov et al., 2021). Это означает, что антитела были обнаружены у всех участников. Однако в ходе нашего исследования мы получили иные данные».

Вектор:

Добровольцы I-II фазы были здоровы, у них не было хронических заболеваний, они проживали в условиях стационара, и за их состоянием велось постоянное наблюдение. По этой причине цифры могут отличаться. Сложно было ожидать, что абсолютно у всех привитых будет наблюдаться сероконверсия. Кроме того, авторы данной публикации не приводят оценки доверительных интервалов, но приводят численность групп и результаты, так что эти оценки можно рассчитать самостоятельно.
По нашему мнению, не является корректным прямое сравнение процентов и вычитание процентов как поправки. В целях сравнения могут быть использованы методы статистики. Так, для результата, полученного в отношении 19 человек, ни точный тест Фишера, ни тест Хи-квадрат не показали никакой статистически достоверной разницы между заявленными результатами и практически полной иммунологической эффективностью (18 положительных и 1 отрицательный).
Оценка 95% доверительного интервала для полученной пропорции с помощью биномиального теста дает значения от 43,45% до 87,42%. Таким образом, выборка недостаточна для того, чтобы делать достоверные выводы. Кроме того, отсутствие 100% сероконверсии может быть обусловлено множеством причин.
Для 120 человек доверительный интервал с учетом 25% плацебо и 100% сероконверсии составляет от 66,3% до 82,5%. Но если реальный уровень сероконверсии в расширенных исследованиях ниже 100%, то и здесь в выявленной пропорции нет противоречия. Кроме того, имеются сомнения в репрезентативности выборки. Вычисления иммунологической эффективности, приведенные здесь, не совсем корректны, поскольку не указан 95% доверительный интервал: от 65,5% до 84%. Таким образом, результаты действительно указывают на сероконверсию ниже 100%, что было вполне ожидаемо.

Комментарий исследовательской группы

Все описанные в п.4 официального ответа расчеты уже были сделаны в работе (Лагуткин и Криницкий, 2021), которая есть в списке литературы. Поскольку полученные нами в обсуждаемой статье результаты лежат в пределах доверительных интервалов, мы не видим каких-либо противоречий.

«Предсказание MHC I/MHC II эпитопов в вакцинном антигене».

Вектор:

Пептиды, используемые в вакцине, не нацелены на индукцию Т-клеточного ответа, поэтому обсуждение этой темы в статье представляется неоправданным. Кроме того, несмотря на то, что методы предсказания Т-клеточных эпитопов «довольно точны», никакого экспериментального подтверждения своих предположений авторы не приводят.

Комментарий исследовательской группы

В статье не заявлялось экспериментальное подтверждение полученной модели. Необходимо отметить, что "ГраИс" не является научным институтом и представляет из себя группу энтузиастов, не имеющих внешнего финансирования и собственных лабораторий, поэтому экспериментальные возможности группы в известном смысле ограничены. В статье изначально заявлено моделирование, а в разделе Обсуждение отдельно отмечено, что результаты моделирования не претендуют на высокую научную значимость сами по себе и лишь иллюстрируют неудачность конструкции. В силу этого претензия насчет экспериментального подтверждения данных не ясна. Также см. п.9 данного комментария. Отдельно обратим внимание на то, что на индукцию Т-клеточного ответа, согласно заявлениям разработчика, был направлен N-белок в составе белка-носителя. Более того, без ответа Т-хелперов 2 типа не может развиться гуморальный Т-зависимый ответ.

Однако мы были бы рады провести подтверждающий эксперимент совместно и открыто на независимой площадке, поскольку уверены в адекватности модели.

«Пептид, соответствующий участку 454-477, расположенному в рецептор-связывающем домене S-белка, в растворе представляет из себя две альфа-спирали, соединенные инкером (Рис. 3а)».

Вектор:

Данное утверждение требует уточнений. Каким образом проводилось авторами определение структуры пептида? Если это результаты предсказания – оценивалась ли стабильность структуры в растворе? Оценивалось ли влияние белка-носителя? О «значительном конформационном несоответствии» можно будет говорить только после структурных исследований. Результаты моделирования не могут рассматриваться в качестве доказательства. Более того, вакцина «ЭпиВакКорона» не содержит пептиды в растворенном виде – пептиды «пришиты» к белку-носителю. Авторы вводят читателя в заблуждение, обсуждая несуществующие конструкции растворенных в воде пептидов.

Комментарий исследовательской группы

Судя по опубликованным данным, разработчик даже не попытался хоть как-то оценить конформацию пептидов, которые были включены в состав вакцины.

Поскольку технических возможностей смоделировать фолдинг конъюгированного на носитель пептида нет, модель пептида в растворе является наиболее адекватной для оценки конформационного соответствия. Более того, нет прямых причин полагать, что конъюгация как-то значительно повлияет на конформацию: напоминаем, что белок-носитель представляет собой фьюжн-конструкцию из N-белка коронавируса и MBP-6H, при этом конъюгация, судя по всему, не повлияла на конформацию N-белка - антитела к нему детектировались у ~36% участников исследования. Касаемо стабильности конформации пептида стоит сказать, что эта модель является наилучшей из пяти “best hits”, наиболее стабильной и энергетически выгодной (sOPEP_Energy = -30.0037; подробнее про параметр sOPEP Energy и предсказания структур здесь: Maupetit et al. A coarse-grained protein force field for folding and structure prediction //Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. – 2007. – Т. 69. – №. 2. – С. 394-408 и Lamiable A. et al. PEP-FOLD3: faster de novo structure prediction for linear peptides in solution and in complex //Nucleic acids research. – 2016. – Т. 44. – №. W1. – С. W449-W454).

Оценочное суждение “Авторы вводят читателя в заблуждение, обсуждая несуществующие конструкции” считаем разумным проигнорировать, поскольку оно не является научным аргументом.

«Известно, что антитела к S-белку могут обладать протективностью против SARS-CoV-2 и защищать от ассоциированного с ним заболевания COVID-19 (Ni et al., 2020; Bao et al., 2021), однако нет данных, показывающих, что антитела к другим антигенам коронавируса обладают какими бы то ни было защитными свойствами. Полученные нами результаты противоречат данным, опубликованным разработчиками вакцины о наличии нейтрализующих антител в сыворотках вакцинированных (Ryzhikov et al., 2021)».

Вектор:

В состав обсуждаемого пептида 454-477 из вакцины «ЭпиВакКорона» входят несколько эпитопов с нейтрализующим потенциалом. Ссылки на работы, где это показано, приведены в опубликованной нами статье. В частности, Shrock E. et al. Viral epitope profiling of COVID-19 patients reveals cross-reactivity and correlates of severity. Science. 2020, Vol. 370, no. 6520, eabd4250., где написано, что «Epitope S 454-463 (labeled E6 in Fig. 7) also overlaps ACE2 contact residues and partially overlaps the binding site of the neutralizing antibody CB6, which suggests that antibodies recognizing this epitope also have neutralizing potential».

Комментарий исследовательской группы

В указанной в п.7 официального ответа статье описано, что данный эпитоп просто перекрывается с конформационным эпитопом моноклонального (Shi R. et al. A human neutralizing antibody targets the receptor-binding site of SARS-CoV-2 //Nature. – 2020. – Т. 584. – №. 7819. – С. 120-124: “Here we report the isolation of two specific human monoclonal antibodies (termed CA1 and CB6) from a patient convalescing from COVID-19”) антитела CB6.

Никакого экспериментального подтверждения нейтрализующего потенциала антипептидных антител к данному эпитопу в этой работе не приведено, более того, предложение процитировано из раздела "Обсуждение". Кстати, согласно п.1 официального ответа, моноклональные антитела нельзя сравнивать с поликлональными сыворотками, но, по-видимому, на авторов официального ответа запрет не распространяется.

«Доля заболевших и умерших после полного курса вакцинации не имеет достоверных отличий от средней доли заболевших и умерших по Москве за указанный период (Стопкоронавирус.рф, 2020)».

Вектор:

Сравнение со средними показателями по Москве некорректно, поскольку Плоскирева и соавторы говорят о том, что вакцинированные сотрудники каждый день работали с зараженными людьми, в локальных очагах и т. п., и вероятность заболевания и дозы вируса, которым они были экспонированы, кратно превышают средние показатели по Москве.

Комментарий исследовательской группы

Сотрудники Роспотребнадзора и ЦНИИ эпидемиологии не работают в эпидочагах и красных зонах.

Количество их взаимодействий с вирусом не превышает таковое у среднего жителя Москвы. Предлагаем доказать тезис о том, что сотрудники Роспотребнадзора имеют больший риск инфицирования, чем средний москвич, а также привести конкретные примеры работы людей из выборки вакцинированных в эпидочагах.

Работа с патматериалом не является особенным фактором риска при работе в BSL3 лабораториях: нам не удалось найти описанных случаев заражения SARS-CoV-2 от патматериала в лабораторных условиях.

«Строго говоря, обсуждаемое исследование (Плоскирева и соавт., 2021) не является научной работой в общепринятом смысле, поскольку в нем не приведено достаточно оснований для выводов об эффективности вакцины, а сероконверсия оценивается безотносительно протективной способности выявляемых антител».

Вектор:

Данная работа также не является полноценной научной работой, поскольку содержит значительное количество оценочных суждений и предположений, не подтвержденных экспериментами.

Комментарий исследовательской группы

Мы рады, что авторы официального ответа разделяют нашу позицию по поводу упомянутой статьи (Плоскирева и соавт., 2021).

В то же время не можем не указать на то, что моделирование является самостоятельным экспериментом. Ссылаться на результаты моделирования абсолютно корректно: существуют большие и серьезные работы, посвященные предсказаниям тех или иных взаимодействий, посттрансляционных модификаций или структур. Например, журнал Cell Host&Microbe (импакт-фактор 15.9) не увидел ничего ненаучного в полностью биоинформатической работе Grifoni A. et al. A sequence homology and bioinformatic approach can predict candidate targets for immune responses to SARS-CoV-2 //Cell host & microbe. – 2020. – Т. 27. – №. 4. – С. 671-680. e2. (у статьи 500+ цитирований), в которой нет "экспериментальной" части. Таких работ более чем достаточно. Считаем некорректным называть ссылки на результаты моделирования "оценочными суждениями и предположениями, не подкрепленными экспериментами".

Таким образом, обсуждаемая статья группы “ГраИс” несомненно является научной, тогда как о работе (Плоскирева и соавт., 2021) это сказать сложно по описанным в нашей статье причинам.

«Однако они неспособны связывать наиболее значимый вирусный антиген и нейтрализовать вирус. Вместе с узким пулом антител мы получаем и широкий пул хелперных Т-клеток 2 типа, значительная часть которых распознает линкерный участок или эпитопы бактериального белка и, как и поствакцинальные антитела, не обладает каким-либо протективным эффектом».

Вектор:

Данное утверждение считаем неуместным, поскольку отсутствует его экспериментальное подтверждение. Результаты наших исследований показывают, что тест-система «SARS-CoV-2-IgG-Вектор» способна детектировать специфические антитела у переболевших COVID-19. Оценочное предположение об отсутствии какого-либо протективного эффекта поствакцинальных антител и вероятного Т-хелперного иммунного ответа является именно предположением, поскольку никак не подтверждается.

Комментарий исследовательской группы

Утверждение, процитированное в п.10 официального ответа, основано на данных тщательно описанного в статье эксперимента и результатах моделирования.

Отсутствие защитного эффекта поствакцинальных антител продемонстрировано в разделе Результаты обсуждаемой статьи, чего не могли не видеть авторы официального ответа. Детекция каких бы то ни было антител тест-системой SARS-CoV-2-IgG-Вектор не может служить аргументом чего-либо, поскольку неизвестен состав ее антигена.

Согласно п.9 нашего комментария, считаем неуместным и некорректным называть данные моделирования "оценочным предположением".

Комментарий Ольги Матвеевой

«Результаты наших исследований показывают, что тест-система «SARS-CoV-2-IgG-Вектор» способна детектировать специфические антитела у переболевших COVID-19»

В этой способности тест-системы нет диагностической ценности. Она не может дать надежную оценку о наличии протективных по отношению к вирусу антител. Вся известная научная литература по SARS-CoV-2 свидетельствуют о том, что у переболевших почти всегда детектируется много антител на вирусный нуклеокапсидный белок и на шиповидный белок (S-белок). Однако именно уровень антител на S-белок лучше всего коррелирует с защитной функцией гуморального ответа. Так что аргумент, что тест-система Вектора видит антитела у переболевших не означает, что она может видеть именно защитные антитела.

«Оценочное предположение об отсутствии какого-либо протективного эффекта поствакцинальных антител и вероятного Т-хелперного иммунного ответа является именно предположением, поскольку никак не подтверждается.»

А где в данных разработчиков (научных статьях, препринтах) подтверждается наличие Т-хелперного ответа, который так необходим для появления противовирусных антител?

«Затем в каждую лунку вносили суспензию коронавируса (штамм SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 (Chepurnov et al., 2020)) в дозе 100 ЦПЕ50 (цитопатических единиц)».

Вектор:

Не представлено данных по методике постановки вируснейтрализации, и отсутствует ссылка на лабораторию с уровнем биобезопасности BSL-3, в которой разрешено проведение исследования с микроорганизмами II группы патогенности.

Комментарий исследовательской группы

Методике постановки реакции нейтрализации посвящена целая страница раздела Материалы и методы (c.11-12), чего не могли не заметить авторы официального ответа.

Из п.10 и п.11 официального ответа складывается впечатление, что авторы ответа не читали обсуждаемую статью, иначе не вполне ясно, как можно было не увидеть столь явно и довольно многословно описанные аспекты. Хотим также отметить, что не видели ни в одной статье названий лаборатории в разделе Материалы и методы. Нет такой информации в том числе и в статье (Ryzhikov et al., 2021). Если у авторов официального ответа есть какие-либо сомнения по поводу данного эксперимента, мы будем рады, если они организуют новый аналогичный эксперимент в независимой от Роспотребнадзора лаборатории BSL3.